双抗项目聚体多，一不小心就中招
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今天羊驼博士就带大家一起看看
POROS的疏水填料
在流穿模式下对双抗项目中聚体去除的
效果及背后隐藏的机理
●简 介●
减少和控制产物相关杂质是双特异性抗体纯化工艺开发过程中的主要挑战。目标产物变体（例如聚体和片段）去除的困难源于它们性质的相似性，相近的等电点、小的表面电荷差异和对不同盐盐和pH条件的疏水性。因此，许多双特异性抗体纯化过程需要多个步骤来减少杂质。这里研究了三种疏水相互作用层析（HIC）填料（POROS Ethyl，Benzyl和Benzyl-Ultra），用于去除基于大肠杆菌的表达系统（XpressCF+™）中产生的双特异性抗体的聚集体。进一步研究了POROS苯甲基疏水填料的最佳工艺参数。
●研究目标●
对系列填料在双抗在聚体去除效果上的对比，包括结合洗脱模式及流穿模式。
评估POROS 疏水填料在聚体去除上的效果和双抗单体回收率。
研究POROS Benzyl 在放大规模上对于聚集体去除的动态载量。
●物料与耗材●
双特异性抗体：大肠杆菌无细胞系统(XpressCF+™)表达的bsAb1
耗材：
低疏水性和高疏水性HICPreDictor 96孔板
POROS Ethyl, Benzyl和Benzyl Ultra 1mL预装柱
层析柱: Tricorn, HiScale, and AxiChrom
设备和软件
AKTA Avant 25, 150和Pilot 系统
Unicorn 7.3
UHPLC 1290 Infinity II System
Chromeleon 7.2
●方 法●
图1 全部筛选的疏水填料的疏水性大小排序
图2开发bsAb1纯化工艺的疏水填料从筛选到优化的7大主要步骤流程图
筛选琼脂糖基架疏水填料
结合洗脱模式和流穿模式筛选的12种琼脂糖基架疏水填料
在PreDictor 板和1mL 柱子上测试
图3 疏水填料筛选每步收率图
高盐条件在结合洗脱模式下容易形成bsAb1沉淀
流穿模式下收率低且bsAb1形成的聚体去除效果有限
POROS疏水填料筛选
图4. UPLC-SEC 分析上POROS填料上样流穿液表1 三种疏水填料在聚体去除上的对比
POROS Ethyl（疏水性最弱的填料）POROS Benzyl 和Benzyl Ultra（疏水性最强的填料）通过上Protein A纯化的料液 到15cm高的疏水柱上来测试。
聚体去除效果排名为 Benzyl-Ultra > Benzyl > Ethyl，收率则刚好相反。
POROS Benzyl 在bsAb1聚体去除效果和收率上表现非常出色。
POROS Benzyl优化
测试条件：
盐种类(NaCl , Na2SO4etc.)
盐浓度(10 –200 mM)
保留时间(2 –4 min, 通过柱子长度和流速计算)
上样量(10 –250 g/L resin)
不同批次规模(0.2 L to 200 L)
图5 POROS Benzyl 两种规模下流穿模式重叠图谱
注：Strip1 with water, strip2 with 1M acetic acid, CIP with 1M NaOH
表二POROS Benzyl 在放大180倍后的聚体去除一致性
高载量下聚体去除
15-20% 聚体去除维持
75-85% bsAb1 单体回收率
实验条件：
线速度: 400 cm/hr;
层析柱规格: 0.5 cm (D) x 15 cm (L)
保留时间: 3 min;
最大上样量: 200g/L。
方框内的上样载量可以使高聚体去除15-20% ，单体回收率在 75-85%之间。
图6双抗聚体在POROS Benzyl填料FT模式下的流穿
bsAb1双抗聚体在疏水填料上的去除机理
图7疏水填料去除双抗聚体机理示意图
图7 第一根柱子可以看出：
在柱子上的结合力：单体和片段< 聚体
在柱子中的流动性：单体和片段> 聚体
从第二根柱子可以看出：
聚体把结合在柱子上的单体置换出来。
●总 结●
1、文章显示POROS 填料在优化好的条件下可以在维持高单体回收率的同时具有去除聚体的优越能力。
2、POROS Benzyl 流穿模式可以去除>10-20% 聚体（取决于上样量），可以很好的作为中间层析步骤。
3、研究结果表明，在有效分离双特异性抗体和其聚集体的过程中，聚集体的去除可以通过流穿模式取代吸附洗脱模式。
4、聚体去除能力在高上样量下具有很高的一致性。
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