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作者丨挑食的免疫喵
全球双特异性抗体中，约50%选择anti-CD3招募T细胞作为其中一个靶点，但是传统anti-CD3在招募T细胞发挥杀伤肿瘤细胞作用，同时会引起严重的细胞因子释放综合征（CRS）或者神经炎症，对药物临床使用带来一些障碍。
Teneobio是一家新锐生物制药企业，2月份，艾伯维（AbbVie）与其达成9000万美金协议，共同开发其TNB-383B（CD3XBCMA）。该双特性抗体，最大的特点是筛选独特的Anti-CD3 arm，具有激活T细胞，裂解肿瘤，同时降低细胞因子释放综合征。
基于抗体库测序分类的新型anti-CD3筛选策略
第一代T细胞招募双特异性抗体（T-bsABs）遇到了与细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性相关的临床副作用，一定程度上阻碍了其临床应用，驱动开发下一代有效抑制肿瘤细胞裂解的分子，同时避免了高水平的细胞因子释放，可允许更广泛的单药使用，或者联合治疗。
先前研究，天然T细胞活化需要T细胞受体（TCR）与肽-MHC复合物的相互作用（pMHC），但引起高水平细胞因子释放。Faoudi等人指出，在低水平TCR：pMHC接合，在细胞因子释放前，T细胞能够杀死靶细胞。
因此，更精细调节的结合特性和激动性CD3-接合臂的活动，T-bsAB可能更紧密模拟TCR：PMHC接合，引起T细胞活化。
新CD3结合结构域的开发，驱动T-BsAb实现更自然的T细胞结合。
第一代T-BsAb，几乎75%的已发表的CD3结合域来自于几种杂交瘤衍生抗体，例如OKT 3、UCHT 1、TR66，这些抗体的结合亲和力低至1nM。使用这些高纯度的CD3-结合臂往往显示出对肿瘤细胞有很强的杀伤作用，细胞因子释放水平较高。
为了拓宽下一代T-BsAb的治疗窗口，需要寻求建立一个将肿瘤细胞杀伤与细胞因子释放分离的平台。美国生物制企业Teneobio开发了一个新的平台，以下一代测序NGS为基础，在固定轻链人源化大鼠体内发现了一组新的抗CD3抗体，与CD3上的多个表位结合，具有广泛的结合强度和激动剂活性。
双特异性抗体的功能评估显示，T-bsAb的建立具有良好的新的T细胞结合域，可引起体内肿瘤细胞的强烈杀伤和低水平的细胞因子释放。
传统方法，鉴定CD3的抗体与细胞表面T细胞受体结合是由挑战的。传统的抗体发现方法，如噬菌体展示、酵母展示，单细胞筛选B细胞，倾向于高亲和力结合体，这使筛选具有一个范围激动强度的天然anti-CD3抗体，变得复杂。
Teneobio基于NGS技术抗体库测序的anti-CD3开发方法，该方法使用固定轻链的转基因OmniFlic大鼠。这个策略独特的优势，用于鉴定具有广泛表位覆盖和多种结合强度和功能活性的激动型抗体。
OmniFlic大鼠用预先重排的人kappa轻链转基因表达人IgG抗体，它们依赖于基于转基因的人类重链vd-j基因序列的重排来产生抗体多样性。
大鼠内源性重链、kappa和lambda位点已被敲除。这种方法产生了非常大规模和多样化的完全人类序列定义的抗体库，并且固定的轻链格式使得能够轻松地与各种其他结构域配对，以实现双特异性结合和很好的可生产的特性。
基于此策略，CD3免疫的OmniFlic大鼠，产生了大于100个候选的抗体家族。抗体谱和系分析产生的大于120个克隆还有互补决定区3（CDR3）克隆，他们是强的抗原特异性抗体。一个克隆类型代表CDR3的序列相似度80%以上，代表来自于同一个原始V-D-J序列重排。
从一个克隆型家族中选出代表378个独特抗体成员，通过高通量基因组装、重组表达和初步功能筛选。用ELISA和流式细胞术检测转染上清液中人固定轻链抗体（FlicAbs）与人CD3δε蛋白的结合。
约有20%的候选抗体与重组人CD3δε蛋白结合，但更少的候选抗体与Jurkat细胞上天然存在，且作为T细胞结合受体一部分的CD3结合。Jurkat阳性结合物与CD3阴性细胞无明显结合。
初筛鉴定了11/378新型FlicAbs抗体，特异性结合CD3阳性Jurkat细胞，代表来自两个不同的CDR3克隆型家族的多个独立和自然存在的成员（以下称为F1和F2）
为了实现具有多种激动剂活性的CD3结合抗体，我们启动了二次分集式筛选，以在两个JurJat结合CDR3家族中测量包含CDR1、CDR2和骨架区域中的序列变化的其它独特的VH序列。
从CDR3 ClonType系列F1和F2中选择其他独特的VH序列进行进一步评估。在第二轮高通量基因组装和表达之后，通过流式细胞术评价来自F1的163个成员和来自F2的34个成员，家族成员通过附加到F1或F2末端的字母彼此区分。
这两个家族共鉴定出139种独特的结合抗体，代表着广泛的细胞结合强度。这种大量和多样的新型CD3结合抗体能够随后努力识别用于T-BSAB格式的最佳抗CD3结合结构域。
抗CD3单克隆抗体的评价
选择了两种来自F1和F2的抗体，代表来自两个家族的更强和较弱的细胞结合力，用于体外功能测试。
流式细胞术用于评价相对JurJat细胞结合强度和诱导原代人或食蟹猴外周血单核细胞（PBMC）样品中T细胞活化的能力。有趣的是，在18小时后由CD69表达测量的人PBMC中的最大T细胞活化水平，对于所有四个测试的抗体是相同的，但观察到效价的显着变化。细胞结合剂量曲线显示相对激活效力与JurJat细胞结合强度相关。
随后的研究表明，来自F1的两种抗体都能激活猴的原代T细胞，而F2的成员不具有此功能，提示F1和F2的抗体可能与CD3上的不同表位结合。
首先，通过流式细胞术评估每个抗体与表达人CD3-表达JurJat细胞或食蟹猴表达CD3的HSC-F细胞结合，证实所有抗CD3抗体都与细胞表面人CD3结合，但只有F1抗体是食蟹猴反应性的。
接下来，我们使用Biolayer干涉测量法来评价与重组 CD3ε, CD3δε 或 CD3γε结合的抗体。我们观察强的OKT3与CD3δε和CD3γε异二聚体结合。相反，新的F1和F2抗体显示出对CD3δε的强有力的结合，但较弱（F1）或不能检测到（F2）结合到CD3γε。所有抗体均未结合到CD3ε。
最后，我们测量了OKT3和F1或者F2抗体通过用一种未标记的抗体对细胞进行预处理，然后通过流式细胞术定量第二标记抗体的结合的能力。
我们观察到，当细胞被F1和F2抗体预饱和时，随后的OKT3结合水平降低约一半。然而，当OKT 3第一次结合时，F1和f2抗体与Jurkat细胞相互作用的能力几乎完全消失。
考虑到每个T细胞受体包含一个CD3δε异二聚体和一个CD3γε异二聚体，这些结果可以通过F1和F2抗体分别与cd 3δε的优先或排他性结合来解释。虽然F1和F2抗体表现出不同的食蟹猴反应特性，但它们相互竞争，相互结合，并可能与重叠的表位相互作用。
综上所述，这些数据证实，我们已经确定了一套新的抗CD3抗体，特点是不同的结合谱。
双特异性抗体格式下新anti-CD3结合结构域的功能活性
在双特性抗体的格式下，检验抗CD3臂，我们从F1和F2中选择了12个不同的CD3结合区，根据其广泛的结合强度和T细胞活化谱，在沉默和稳定的人IgG4Fc上用一个共同的抗TAA臂表达,使用knobs-into-holes的突变方法帮助形成重链异二聚体。
共享的肿瘤靶向性臂由两个抗b细胞成熟抗原（BCMA）VH结合区组成，结合到细胞表面的BCMA具有纳摩尔亲和力。为比较12种抗CD3抗体的功能活性，表达、纯化CD3xBCMA双特异性抗体，并对其抗原依赖的T-bsAB介导的肿瘤细胞杀伤活性进行评价。
活性最强的分子的EC 50值与其他CD3xBCMA双特异抗体相似，无非特异性杀伤。作者选择两个家族各选择一个较强作用的anti-CD3（F1F和F2B），进入后续功能研究。
Anti-CD3双特异性抗体外鉴定
如下图在获得相近肿瘤杀伤效果的情况下，F2B产生更低细胞因子释放。
Anti-CD3双特异性抗体外鉴定
为证实含CD3_F2B双特异性抗体的体外杀伤和细胞因子释放谱与体内疗效一致，采用播散性多发性骨髓瘤小鼠模型，比较CD3_F1FxBCMA和CD3_F2BxBCMA的功能作用。
将表达荧光素酶的BCMA阳性人RPMI-8226细胞给予NSG小鼠，分别给予1剂人PBMCs和3剂CD3xBCMA双特异性抗体（图A）。
对CD3_F2BxBCMA分子而言，在多个剂量水平下，对肿瘤细胞有较强的杀伤作用，最高剂量（10μg）显示肿瘤接近完全清除。
而强激活CD3_F1FxBCMA抗体在极低~中等剂量下也显示出肿瘤清除率，但10μg剂量的肿瘤负担与非靶向阴性对照相当。
结语
T-BsAb通过以肿瘤抗原依赖的方式激活内源性T细胞，显示出了巨大的临床疗效。然而，由于剂量限制毒性，第一代T-BsAbs的临床应用被狭窄的治疗窗口所削弱。T-BsAb的治疗谱高度依赖于其分子形式和各结合臂（抗CD3和抗TAA）的功能特性。
肿瘤细胞的抗原密度和T-BsAb结合臂的相对亲和力是生物分布、T细胞活化或衰竭程度以及刺激细胞因子释放的重要决定因素。
虽然临床医生有管理细胞因子释放相关毒性的有效工具，但有希望将具有更宽治疗窗口的下一代T-BsAb作为单一药物，用于治疗范围广泛的肿瘤类型，并与检查点抑制剂等其他已获批准的治疗方法相结合。
我们开发了一种新的CD3-结合抗体，作为一个强大的下一代双特异性T细胞重定向平台的基础。在人源化固定轻链大鼠中，通过抗体库序列测序，发现了一组新的抗CD3抗体，以鉴定天然存在的、完整的人CD3结合抗体，这些抗体与不同亲缘度的多个表位结合。
通过双特异性抗体的筛选，我们成功地建立了新的细胞因子释放水平较低的T-BsAb，在体外和小鼠异种移植模型中保持了有效的肿瘤溶解活性。
CD3_F1F-与含CD3_F2B的BsAb在小鼠异种移植模型中的差异行为也很有趣，更强的激活CD3_F1FxBCMA分子在高剂量下明显失去作用。
由于T细胞衰竭或AICD，这种体内效应的丧失与T细胞的强烈结合有关。另外，不同T-BsAb的CD3-靶向和肿瘤靶向臂的相对结合强度可能会影响小鼠模型中的生物分布模式，进而影响肿瘤清除率。
Mandikian等人最近的工作。在人CD3ε转基因小鼠中，虽然低亲和力的CD3-含BsAb具有抗HER 2臂靶向性强的异种肿瘤移植瘤，但具有相同抗肿瘤臂的高亲和力CD3-BsAb对脾脏和淋巴结的定位增强。以高亲和力抗CD3-ARM为基础的T-BsAb与肿瘤细胞前T细胞结合，有可能对体内的功能活性有显着影响。
相反，T-bsAb在与T细胞结合之前结合于肿瘤细胞，使用高亲和力的抗肿瘤手臂与低亲和力的CD3靶向臂结合，可能更接近于通过TCR与T细胞的结合和激活。
更多的研究正在进行中，以了解抗原表位和CD3靶向臂的亲和力对体外杀伤和细胞因子释放水平的相对贡献，以及体内影响有效剂量范围的机制。最终，临床研究将需要充分描述我们基于CD3_F2B的双专一平台的治疗窗口，针对液体和实体肿瘤的多个方案正在向临床发展。
参考文献Efficient tumor killing and minimal cytokine release with novel T-cell agonist bispecific antibodies，MABS , VOL. 11, NO. 4, 639–652
转载声明：本文经「闲谈 Immunology」授权转载。
▼同写意15周年大会日程正式发布
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