本发明涉及一种合成利拉鲁肽的方法，属于多肽合成
技术领域：
。
背景技术：
：利拉鲁肽，英文名liraglutide，为丹麦诺和诺德公司自主研发，是一种长效治疗ii型糖尿病的胰高血糖素样肽1(glp-1)类似物，属于glp-1受体激动剂，是首个为ii型糖尿病治疗开发的人高血糖素样多肽-1(glp-1)类似物。该药于1月25获得fda批准上市，于3月4日获sfda批准在中国上市。利拉鲁肽作为新一代以肠促胰岛素为基础的降血糖药物，不仅作用时间长，而且充分保留了天然glp-1的多项生理活性，可安全有效降糖并可能对多种心血管危险因素有保护作用，为2型糖尿病的治疗带来了新的选择。临床治疗效果令人鼓舞。目前已报道的利拉鲁肽的合成方法主要采用固相合成，主要分为常规法和片段法，都有一定程度上的缺陷：比如中国专利cn102286092b中用到了fmoc-lys(alloc)-oh，在最后的脱除中用到了重金属钯，后续重金属很难去除干净影响产品的品质；中国专利cn103980358b将修饰后的lys接入主链，由于侧链基团大活性低，容易偶联不完全，且采用的是常规缩合体系，对于后续氨基酸的偶联造成一定程度上的困难，产生大量的缺失肽和消旋肽等杂质肽，影响下游纯化；中国专利cn103864918b把肽链分为三个片段进行偶联，该方法浪费原料，且对于中间体片段需进行质量控制，步骤繁琐又增加了成本，得不偿失。因此，急需一种简单而高效的利拉鲁肽的合成方法。技术实现要素：为解决上述技术问题，本发明提供一种利拉鲁肽的制备方法，本发明的方法采用缩合剂pybrop，提升了偶联效率，减少了杂质的产生，提高了粗肽的纯度和收率，降低合成成本；且本发明采用boc-his(trt)-osu，fmoc-ala-osu做原料，减少杂质的产生，进一步提高了粗品的纯度和收率。本发明的第一个目的是提供一种合成利拉鲁肽的方法，包括如下步骤：(1)通过固相合成法，按利拉鲁肽主链c端至n端肽序，采用缩合剂偶联体系进行氨基酸的活化偶联，得到利拉鲁肽9-37全保护肽树脂；其中，26位lys采用fmoc-lys(pal-glu-otbu)-oh为原料；再采用碱催化体系将fmoc-ala-osu和boc-his(trt)-osu依次连接到利拉鲁肽9-37全保护肽树脂上，得到利拉鲁肽主链肽树脂；(2)利拉鲁肽全保护肽树脂经裂解后得到利拉鲁肽粗肽；(3)经纯化，冻干，得到利拉鲁肽成品。进一步地，所述的碱催化体系为n,n-二异丙基乙胺或n-甲基吗啡啉。进一步地，所述的缩合剂偶联体系为pybrop与碱的混合体系，所述的碱为n,n-二异丙基乙胺(diea)或n-甲基吗啡啉(nmm)。进一步地，所述的pybrop和碱用量分别为氨基酸1～2倍和2～4倍摩尔量。优选pybrop和碱用量分别为氨基酸1.2倍和3倍摩尔量。进一步地，在步骤(1)中，采用替代度为0.2～0.35mmol/g的fmoc-glywang树脂作为固相载体树脂。进一步地，在步骤(1)中，boc-his(trt)-osu和fmoc-ala-osu的偶联采用碱催化，所述的碱为n,n-二异丙基乙胺(diea)或n-甲基吗啡啉(nmm)。进一步地，在步骤(2)中，所述裂解的裂解液按体积含量为90％～95％tfa、1％～5％间甲酚、1％～5％edt和1～5％水，裂解液的加入量为10～12ml/g利拉鲁肽全保护肽树脂。进一步地，在步骤(2)中，所述的裂解是在20～30℃反应2-3h。进一步地，所述的方法还包括利拉鲁肽纯化、脱盐和冻干步骤。进一步地，一种合成利拉鲁肽的方法，具体包括如下步骤：(1)采用15～30％哌啶/dmf去保护液脱除fmoc-gly-wang树脂上的fmoc保护基，得到h-gly-wang树脂；(2)通过固相偶联合成法，按利拉鲁肽主链c端至n端肽序，采用缩合剂pybrop依次将fmoc-arg(pbf)-oh﹑fmoc-gly-oh、fmoc-val-oh﹑fmoc-leu-oh﹑fmoc-trp(boc)-oh﹑fmoc-ala-oh﹑fmoc-ile-oh﹑fmoc-phe-oh﹑fmoc-glu(otbu)-oh﹑fmoc-lys(pal-glu-otbu)-oh﹑fmoc-ala-oh﹑fmoc-ala-oh﹑fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-gly-oh﹑fmoc-glu(otbu)-oh﹑fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh的氨基酸活化偶联，依次将氨基酸接到步骤(1)h-gly-wang树脂中，得到利拉鲁肽9-37全保护肽树脂；(3)采用碱催化反应依次将fmoc-ala-osu和boc-his(trt)-osu接到步骤(2)利拉鲁肽9-37全保护肽树脂中，得到利拉鲁肽全保护肽树脂；(4)利拉鲁肽全保护肽树脂经裂解后得到利拉鲁肽粗品；(5)步骤(4)的利拉鲁肽粗品经反向高效液相色谱纯化、脱盐，冻干后得到利拉鲁肽。进一步地，所述反相高效液相色谱法纯化条件为：流动相：a相为：20mmol/l碳酸钠溶液(ph用磷酸调至9)，b相为：乙腈；色谱填料：纳微c18填料；检测波长：220nm；洗脱条件为流速80ml/min,a相和b相的混合液中b相的体积百分比为在40min内由30％升至45％。进一步地，所述脱盐条件为：流动相：a相纯化水；流动相b相为acn；色谱填料：纳微c4聚合物填料；检测波长：220nm；洗脱条件：a相和b相的混合液，其中b相的体积百分比为在40min内由10％升至50％。本发明的有益效果是：(1)本发明采用高效新型缩合剂pybrop，提升偶联效率，减少了杂质的产生，提高了粗肽的纯度和收率，降低了合成成本；(2)本发明采用了boc-his(trt)-osu和fmoc-ala-osu作为原料，减少了难除杂质d-his和d-ala的产生，大大提高了下游纯化收率；(3)采用本发明合成的利拉鲁肽经hplc纯化精制后，纯度达到99.69％，总收率达到38.7％，较以往报道的方法有明显提高。附图说明图1为利拉鲁肽合成工艺路线图；图2为利拉鲁肽产品的hplc图；图3为利拉鲁肽产品的ms图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。表1本发明相关名词解释fmoc9-芴甲氧羰基pybrop三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐pbf2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基trt三苯甲基tbu叔丁基otbu叔丁氧基dmfn，n-二甲基甲酰胺dcm二氯甲烷diean，n-二异丙基乙胺nmmn-甲基吗啡啉tfa三氟乙酸tis三异丙基硅烷edt1，2-乙二硫醇alloc烯丙氧羰基boc叔丁氧羰基acn乙腈实施例1：利拉鲁肽全保护肽合成本实施例利拉鲁肽全保护肽指的是：boc-his(trt)7-ala8-glu(otbu)9-gly10-thr(tbu)11-phe12-thr(tbu)13-ser(tbu)14-asp(otbu)15-val16-ser(tbu)17-ser(tbu)18-tyr(tbu)19-leu20-glu(otbu)21-gly22-gln(trt)23-ala24-ala25-lys(pal-glu-otbu)26-glu(otbu)27-phe28-ile29-ala30-trp(boc)31-leu32-val33-arg(pbf)34-gly35-arg(pbf)36-gly37-wangresin。a.将100g(30mmol)替代度为0.3mmol/g的fmoc-gly-wangresin加入反应柱中，加入400mml二氯甲烷溶胀30min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/dmf溶液300ml，混合5min后，抽干，加入dmf300ml洗涤1min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/dmf溶液300ml，混合15min后，抽干。加入dmf300ml洗涤1min后抽干，重复dmf洗涤4次。取少量树脂进行kaiser法(茚三酮)检测，显阳性，即脱fmoc脱除完成。b.称取58.39gfmoc-arg(pbf)-oh于干净的1l烧杯，加入dmf300mldmf溶液，置于冰水浴条件下用磁力搅拌器搅拌，待氨基酸全部溶解后，依次加入pybrop16.78g，diea47.16ml，继续搅拌活化5min。将以上活化液缓慢加入到反应釜中，常温下反应2h，取少量树脂进行kaiser法检测，显阴性，即偶联完全。反应结束后，抽干反应液，加入dmf300ml洗涤1min后，抽干，重复dmf洗涤2次，即得到fmoc-arg(pbf)-gly-wangresin。c.按如上a的脱保护方法和b的偶联方法，按利拉鲁肽序列35～9的先后顺序，依次分别偶联剩余氨基酸，即：fmoc-gly-oh、fmoc-val-oh﹑fmoc-leu-oh﹑fmoc-trp(boc)-oh﹑fmoc-ala-oh﹑fmoc-ile-oh﹑fmoc-phe-oh﹑fmoc-glu(otbu)-oh﹑fmoc-lys(pal-glu-otbu)-oh﹑fmoc-ala-oh﹑fmoc-ala-oh﹑fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-gly-oh﹑fmoc-glu(otbu)-oh﹑fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh的偶联。d.按a的脱保护方法脱除fmoc，另称取36.76gfmoc-ala-osu于干净的1l烧杯，加入dmf300mldmf溶液，置于冰水浴条件下用磁力搅拌器搅拌，待氨基酸全部溶解后，加入diea47.16ml，继续搅拌活化5min。将以上活化液缓慢加入到反应釜中，常温下反应2h，取少量树脂进行kaiser法检测，显阴性，即偶联完全。反应结束后，抽干反应液，加入dmf300ml洗涤1min后，抽干，重复dmf洗涤2次，即得到利拉鲁肽8-35肽树脂。e.按d的偶联方法，偶联7位boc-his(trt)-osu，即得到利拉鲁肽全保护肽树脂。实施例2：利拉鲁肽粗品的制备向实施例1中得到的利拉鲁肽全保护肽树脂中加入2500ml裂解液，配比为tfa：90％～95％、间甲酚：1％～5％、edt：1％～5％、纯化水：1～5％，室温下裂解2～3h，抽滤，将滤液加入10倍体积预冷的甲基叔丁基醚中沉淀，离心，再用甲基叔丁基醚将沉淀洗涤3次，真空干燥，得到利拉鲁肽粗肽。实施例3：利拉鲁肽粗肽的纯化用反相高效液相色谱对粗肽进行两步纯化：第一步纯化，流动相a为20mmol/l碳酸钠溶液(ph用磷酸调至9)，b相为：乙腈；第二步为纯化对纯品的脱盐，流动相a为纯化水，流动相b为acn；两步纯化均为梯度洗脱，洗脱梯度：第一步为流动相b相30％～45％，纳微c18填料；第二步纯化脱盐为b相10％～50％，纳微c4聚合物填料，洗脱时间均为40min，紫外检测波长220nm。经浓缩冻干得到利拉鲁肽纯品。经检测利拉鲁肽纯品纯度99.66％，单杂均小于0.15％，纯化收率达到67.5％。以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本
技术领域：
的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。当前第1页1 2 3
技术特征：
1.一种合成利拉鲁肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)通过固相合成法，按利拉鲁肽主链c端至n端肽序，采用缩合剂偶联体系进行氨基酸的活化偶联，得到利拉鲁肽9-37全保护肽树脂；其中，26位lys采用fmoc-lys(pal-glu-otbu)-oh为原料；再采用碱催化体系将fmoc-ala-osu和boc-his(trt)-osu依次连接到利拉鲁肽9-37全保护肽树脂上，得到利拉鲁肽主链肽树脂；
(2)利拉鲁肽全保护肽树脂经裂解后得到利拉鲁肽粗肽；
(3)经纯化，冻干，得到利拉鲁肽成品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的碱催化体系为n,n-二异丙基乙胺或n-甲基吗啡啉。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的缩合剂偶联体系为pybrop与碱的混合体系，所述的碱为n,n-二异丙基乙胺或n-甲基吗啡啉。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的pybrop和碱用量分别为氨基酸1～2倍和2～4倍摩尔量。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，采用替代度为0.2～0.35mmol/g的fmoc-glywang树脂作为固相载体树脂。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述裂解的裂解液按体积含量为90％～95％tfa、1％～5％间甲酚、1％～5％edt和1～5％水。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，裂解液的加入量为10～12ml/g利拉鲁肽全保护肽树脂。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述的裂解是在20～30℃反应2-3h。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括利拉鲁肽纯化、脱盐和冻干步骤。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)采用15～30％哌啶/dmf去保护液脱除fmoc-gly-wang树脂上的fmoc保护基，得到h-gly-wang树脂；
(2)通过固相偶联合成法，按利拉鲁肽主链c端至n端肽序，采用缩合剂pybrop依次将fmoc-arg(pbf)-oh﹑fmoc-gly-oh、fmoc-val-oh﹑fmoc-leu-oh﹑fmoc-trp(boc)-oh﹑fmoc-ala-oh﹑fmoc-ile-oh﹑fmoc-phe-oh﹑fmoc-glu(otbu)-oh﹑fmoc-lys(pal-glu-otbu)-oh﹑fmoc-ala-oh﹑fmoc-ala-oh﹑fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-gly-oh﹑fmoc-glu(otbu)-oh﹑fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh的氨基酸活化偶联，依次将氨基酸接到步骤(1)h-gly-wang树脂中，得到利拉鲁肽9-37全保护肽树脂；
(3)采用碱催化反应依次将fmoc-ala-osu和boc-his(trt)-osu接到步骤(2)利拉鲁肽9-37全保护肽树脂中，得到利拉鲁肽全保护肽树脂；
(4)利拉鲁肽全保护肽树脂经裂解后得到利拉鲁肽粗品；
(5)步骤(4)的利拉鲁肽粗品经反向高效液相色谱纯化、脱盐，冻干后得到利拉鲁肽。
技术总结
本发明公开了一种合成利拉鲁肽的方法，属于多肽合成技术领域。本发明的方法包括如下步骤：以Fmoc‑Gly‑Wang Resin为固相合成起始载体，通过使用新型缩合剂PyBrop(三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐)进行利拉鲁肽(序列C端→N端)37到9位29个氨基酸的活化偶联，其中26位采用Fmoc‑Lys(Pal‑Glu‑OtBu)‑OH作为原料；另第7位和第8位分别采用Boc‑His(Trt)‑Osu、Fmoc‑Ala‑Osu进行缩合，得到利拉鲁肽全保护肽，经裂解沉淀，得到利拉鲁肽。本发明方法提升了氨基酸偶联效率，极大降低了利拉鲁肽合成过程中产生的消旋肽和缺失肽杂质，尤其是有效抑制或减少了与产品性质极为相近的消旋杂质(D‑His7和D‑Ala8)的产生，提高了粗品的纯度，降低了纯化的难度，利于进行工业化放大生产。
技术研发人员：王良友;周黎;郑春旭;沈杰;黄保胜;陈维维;宋亮;张璐
受保护的技术使用者：苏州天马医药集团天吉生物制药有限公司
技术研发日：.12.02
技术公布日：.02.25
如果觉得《一种合成利拉鲁肽的方法与流程》对你有帮助，请点赞、收藏，并留下你的观点哦！
